希釈倍率計算方法・手順・使い方、メリットデメリットなどについて

希釈倍率計算方法・手順・使い方、メリットデメリットなどについて

希釈倍率計算とは、例えば日常生活では、ジュースの原液や洗剤、濃縮調味料等を薄めるときに必要になります。また、ELISAのように、抗原抗体反応を利用した生化学実験や、感度の分析などでも、非常に頻繁に利用される方法です。希釈倍率計算の手順は、まず希釈倍率と、必要な液量を確認することです。必要な液量は、多くの場合、希釈後の量となるので、希釈前の原液やサンプルの量と、それを希釈するための希釈液の量を計算する必要があります。その希釈倍率計算は、何回希釈するかによっても変わってきます。日常生活では一回のことが多いですが、生化学実験では、複数回希釈を繰り返すことが多いのです。

希釈倍率計算の方法概要

まず、一回の希釈について例を挙げましょう。例えば、ある原液を、水やバッファー等の希釈液で2倍に希釈して、100ccの液を作る場合を考えます。原液も希釈液も、ともに、100ccを2で割った50ccが必要になります。次に、例えば4倍に希釈して100ccにする場合を考えます。この場合、まず原液の必要量は、100割る4で25ccになります。そして希釈液の必要量は、100から25をひいた残りの75ccになります。あるいは、原液の必要量に希釈倍率マイナス1をかけても計算できます。つまり、25×(4-1)=75ccです。

希釈倍率計算の手順・方法01

一回の希釈で、希釈倍率が100倍や1000倍などと高い場合は、別のやり方があります。例えば、100ccの液を作る場合は、原液は1cc必要です。希釈液は、100マイナス1で、99cc必要となります。しかし、それほど厳密でなくて問題ない場合は、100ccを測り取る方が楽です。あるいは、100ccを計り取ってから、1ccを除く(捨てる)方法も利用できます。さらに1000倍希釈になると、99.9ccを100ccにしてもほとんど変わらないので、このやり方が便利です。また、原液と希釈液を混合する手順も、原液の容量が少ない場合は、原液に希釈液を添加した方が、むらなく混ざります。

希釈倍率計算の手順・方法02

今までは、一回のみの希釈の方法を説明しましたが、生化学実験等では、複数回の希釈を行うことがよくあります。その流れは、原液と希釈液を混合してできた液から、さらに一部を取り出して、同様に希釈するやり方を繰り返すという手順です。例えば、三倍希釈を繰り返すやり方は、三倍段階希釈という言葉の使い方をします。ELISAでは、調べたいサンプルを三倍段階希釈し、各希釈濃度を50μLずつ3つのウェル(抗原抗体反応を行う小さな井戸型のくぼみ)に分注して調べるという方法がよく行われます。この場合は、二回目以降の希釈に必要な量も考えないといけません。

希釈倍率計算の手順・方法03

例えば、三倍段階希釈を二回行う場合の希釈倍率計算をしてみましょう。各希釈倍率で、50μLずつ3ウェル分が必要なので、合計150μL必要となります。さらに、次の希釈のために50μLを取って150μLにする分が必要です。その次の希釈にも、17μLが必要です。つまり、最初のサンプル量は、合計217μLが最低必要となります。ここから150μLをウェルに分注し、残りの67μLに希釈液134μLを加え、201μLとします。そこから50μLを量り取り、100μLの希釈液を加えて、150μLとするという流れです。

希釈倍率計算の手順・方法04

しかし、実際の生化学実験では、分注のロスと実験の手間も考え、多めの切りのよい量を希釈することが多いのです。先ほどの三倍段階希釈では、各濃度での必要量150μLの二倍の300μLを用意すれば、希釈倍率計算が楽になります。300μLから100μLを量り取り、200μLの希釈液で希釈するというやり方で統一するのです。そうすると、各濃度で200μLが残るので、ここから3ウェルに50μLずつ、合計150μLを分注します。50μLが余るので、もったいないかもしれませんが、計算ミスや希釈ミスをして実験をやり直すほうがもったいないといえます。

希釈倍率計算の手順・方法05

上記のように、100μLの液に200μLの希釈液を混合し、三倍希釈を繰り返すという流れにしておけば、実験も効率的に進められます。ELISAなどでは、サンプルや希釈液をマイクロチューブという小さな容器で希釈したり保存したりします。このマイクロチューブに、あらかじめ希釈液を200μLずつ分注しておくのです。分注にはピペッターという器具を使いますが、ピペッターは、分注量に応じたピペッターを選択したり、目盛りを調節するという使い方をします。そのため、分注量を統一しておけば、同じピペッターで、同じ目盛りで、効率的に希釈液を分注することができるのです。

希釈倍率計算の考察

一定量(200μL)の希釈液をチューブに分注し、一列に並べておいたあとは、サンプルの段階希釈です。ここでも、100μLと一定量に目盛りを固定したピペッターを使用します。まず一番濃い300μLのサンプルから、100μLを量り取り、隣のチューブに分注します。そのチューブには、あらかじめ200μLの希釈液が入っているので、分注と同時に希釈ができるのです。さらに、ピペッターでピペッティング(ボタンを繰り返し押して、液を吸い上げて吐き出す操作を繰り返す)することによって、希釈液とむらなく混合します。ピペッティングの後、また100μLを量り取り、隣のチューブに分注し、同様の操作を繰り返します。

希釈倍率計算のまとめ01(使い方や注意点など)

このように、同じ目盛りに設定した同じピペッターを使用することによって、サンプルの希釈と混合を効率的に行うという使い方が便利です。もし、希釈倍率ごとに希釈液の容量を変えて希釈倍率計算をしてしまうと、希釈倍率に応じて、ピペッターの目盛りを変えたり、ピペッター自体を変えたりする必要があります。その時にミスが起こりやすいですし、手間がかかります。また、三倍などの低倍率の希釈では、各希釈倍率での必要量の二倍程度用意する必要がありますが、もっと高倍率の希釈では、もっと少ない量で十分です。必要量の1.2倍程度で切りの良い量で十分です。

希釈倍率計算のまとめ02(使い方や注意点など)

例えば、10倍の段階希釈の場合を見てみましょう。150μLの必要量に対して、200μLあれば十分です。ここから20μLを量り取り、180μLの希釈液と混合する操作を繰り返します。各希釈倍率で、180μLが残るので、ここから150μLを3ウェルに分注するという流れです。この場合は、30μLしかロスがありませんし、実際は、チューブやチップ(ピペッターに装着し、微量のサンプルを量り取るもの)に付着するロスの分があります。少し余裕を持って、切りの良い量になるように希釈倍率計算を行うと、実験が効率的に行えます。

希釈倍率計算のまとめ03(使い方や注意点など)

ここまでは、一種類の液を希釈する場合でしたが、複数の原液を、それぞれ異なる希釈倍率で希釈する場合もあります。例えば、細胞を培養する培地や、バッファーを調製する場合です。その場合も、各原液について、希釈後の容量を希釈倍率で割って必要量を算出します。全種類の原液の必要量を求めた後、希釈後の容量から、それらの和を引きます。その差が、必要な希釈液の量です。複数の原液を希釈する場合、容量の少ない種類に対し、容量の多いものを添加するという流れのほうが、添加し忘れることが少なくなります。全種類を混合した後に、希釈液を添加すると、むらなく混合することができます。

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