希釈倍率計算方法・手順・使い方、メリット... | 色々なカテゴリの方法や利用・使い方など 方法ラボ

まず、一回の希釈について例を挙げましょう。例えば、ある原液を、水やバッファー等の希釈液で２倍に希釈して、１００ccの液を作る場合を考えます。原液も希釈液も、ともに、１００ccを２で割った５０ccが必要になります。次に、例えば４倍に希釈して１００ccにする場合を考えます。この場合、まず原液の必要量は、１００割る４で２５ccになります。そして希釈液の必要量は、１００から２５をひいた残りの７５ccになります。あるいは、原液の必要量に希釈倍率マイナス１をかけても計算できます。つまり、２５×（４－１）＝７５ccです。

一回の希釈で、希釈倍率が１００倍や１０００倍などと高い場合は、別のやり方があります。例えば、１００ccの液を作る場合は、原液は１cc必要です。希釈液は、１００マイナス１で、９９cc必要となります。しかし、それほど厳密でなくて問題ない場合は、１００ccを測り取る方が楽です。あるいは、１００ccを計り取ってから、１ccを除く（捨てる）方法も利用できます。さらに１０００倍希釈になると、９９．９ccを１００ccにしてもほとんど変わらないので、このやり方が便利です。また、原液と希釈液を混合する手順も、原液の容量が少ない場合は、原液に希釈液を添加した方が、むらなく混ざります。

今までは、一回のみの希釈の方法を説明しましたが、生化学実験等では、複数回の希釈を行うことがよくあります。その流れは、原液と希釈液を混合してできた液から、さらに一部を取り出して、同様に希釈するやり方を繰り返すという手順です。例えば、三倍希釈を繰り返すやり方は、三倍段階希釈という言葉の使い方をします。ELISAでは、調べたいサンプルを三倍段階希釈し、各希釈濃度を５０μLずつ３つのウェル（抗原抗体反応を行う小さな井戸型のくぼみ）に分注して調べるという方法がよく行われます。この場合は、二回目以降の希釈に必要な量も考えないといけません。

例えば、三倍段階希釈を二回行う場合の希釈倍率計算をしてみましょう。各希釈倍率で、５０μLずつ３ウェル分が必要なので、合計１５０μL必要となります。さらに、次の希釈のために５０μLを取って１５０μLにする分が必要です。その次の希釈にも、１７μLが必要です。つまり、最初のサンプル量は、合計２１７μLが最低必要となります。ここから１５０μLをウェルに分注し、残りの６７μLに希釈液１３４μLを加え、２０１μLとします。そこから５０μLを量り取り、１００μLの希釈液を加えて、１５０μLとするという流れです。

しかし、実際の生化学実験では、分注のロスと実験の手間も考え、多めの切りのよい量を希釈することが多いのです。先ほどの三倍段階希釈では、各濃度での必要量１５０μLの二倍の３００μLを用意すれば、希釈倍率計算が楽になります。３００μLから１００μLを量り取り、２００μLの希釈液で希釈するというやり方で統一するのです。そうすると、各濃度で２００μLが残るので、ここから３ウェルに５０μLずつ、合計１５０μLを分注します。５０μLが余るので、もったいないかもしれませんが、計算ミスや希釈ミスをして実験をやり直すほうがもったいないといえます。

上記のように、１００μLの液に２００μLの希釈液を混合し、三倍希釈を繰り返すという流れにしておけば、実験も効率的に進められます。ELISAなどでは、サンプルや希釈液をマイクロチューブという小さな容器で希釈したり保存したりします。このマイクロチューブに、あらかじめ希釈液を２００μLずつ分注しておくのです。分注にはピペッターという器具を使いますが、ピペッターは、分注量に応じたピペッターを選択したり、目盛りを調節するという使い方をします。そのため、分注量を統一しておけば、同じピペッターで、同じ目盛りで、効率的に希釈液を分注することができるのです。

一定量（２００μL）の希釈液をチューブに分注し、一列に並べておいたあとは、サンプルの段階希釈です。ここでも、１００μLと一定量に目盛りを固定したピペッターを使用します。まず一番濃い３００μLのサンプルから、１００μLを量り取り、隣のチューブに分注します。そのチューブには、あらかじめ２００μLの希釈液が入っているので、分注と同時に希釈ができるのです。さらに、ピペッターでピペッティング（ボタンを繰り返し押して、液を吸い上げて吐き出す操作を繰り返す）することによって、希釈液とむらなく混合します。ピペッティングの後、また１００μLを量り取り、隣のチューブに分注し、同様の操作を繰り返します。

このように、同じ目盛りに設定した同じピペッターを使用することによって、サンプルの希釈と混合を効率的に行うという使い方が便利です。もし、希釈倍率ごとに希釈液の容量を変えて希釈倍率計算をしてしまうと、希釈倍率に応じて、ピペッターの目盛りを変えたり、ピペッター自体を変えたりする必要があります。その時にミスが起こりやすいですし、手間がかかります。また、三倍などの低倍率の希釈では、各希釈倍率での必要量の二倍程度用意する必要がありますが、もっと高倍率の希釈では、もっと少ない量で十分です。必要量の１．２倍程度で切りの良い量で十分です。

例えば、１０倍の段階希釈の場合を見てみましょう。１５０μLの必要量に対して、２００μLあれば十分です。ここから２０μLを量り取り、１８０μLの希釈液と混合する操作を繰り返します。各希釈倍率で、１８０μLが残るので、ここから１５０μLを３ウェルに分注するという流れです。この場合は、３０μLしかロスがありませんし、実際は、チューブやチップ（ピペッターに装着し、微量のサンプルを量り取るもの）に付着するロスの分があります。少し余裕を持って、切りの良い量になるように希釈倍率計算を行うと、実験が効率的に行えます。

ここまでは、一種類の液を希釈する場合でしたが、複数の原液を、それぞれ異なる希釈倍率で希釈する場合もあります。例えば、細胞を培養する培地や、バッファーを調製する場合です。その場合も、各原液について、希釈後の容量を希釈倍率で割って必要量を算出します。全種類の原液の必要量を求めた後、希釈後の容量から、それらの和を引きます。その差が、必要な希釈液の量です。複数の原液を希釈する場合、容量の少ない種類に対し、容量の多いものを添加するという流れのほうが、添加し忘れることが少なくなります。全種類を混合した後に、希釈液を添加すると、むらなく混合することができます。